Terápiarezisztenciát okozó transzporterek vizsgálata daganatos betegségben szenvedő kutyák daganatsejtjeiben

Abstract

A multidrog rezisztencia jelenségének felfedezése Robert Koch nevéhez fűződik a XIX. századból. Azonban az első bizonyított kapcsolatra, a sejt membrántranszporter vagy pumpafehérje és a drog rezisztencia kialakulása között, csak a XX. században tettek szert hörcsög petefészek sejtjeit vizsgálva. Az 1970-es évek közepén mutatták ki a 170kDa molekulasúlyú glikoproteint, melyet Pgp-nek neveztek el. Számos sejtvonalon bizonyították, hogy ez a pumpafehérje felelős a multidrog rezisztencia kialakulásáért. A kísérletünkben a sejtek membrántranszporter aktivitását vizsgáltuk, hogy kimutassuk a pumpafehérje funkciót. Munkánk során húsz kutya tumor mintát dolgoztunk fel. Ha a sejtekhez fluoreszkáló molekulát, vagyis calcein-AM festéket adunk és inkubáljuk, az Anyag és módszerben leírtak alapján, akkor ez az anyag a sejtekbe jut. Abban az esetben, ha a sejt rendelkezik a multidrog rezisztencia funkcióval és pumpafehérjékkel (Pgp), akkor a calcein-AM-t a sejtek kipumpálják magukból. Ha a sejteket kapcsoljuk bizonyos fluoreszkáló anyaggal, melyhez immunológiai módszert alkalmazunk és így jelöljük, akkor az adott sejt fluoreszkáló tulajdonsága megváltoztatja a lézerfény törését, így válik lehetővé a sejt elkülönített vizsgálata. Ez a módszer az ún. FACS (fluorescence activated cell sorting) eljárás. Ez alkalmas arra, hogy összehasonlítsuk a sejtek fluoreszcenciáját abban az esetben, ha csak fluoreszcens festéket kapnak (calcein-AM) és ha gátlószert is, verapamilt. A pumpafehérjék gátlásakor a sejtek nem tudják kipumpálni a calcein-AM festéket, így nagyobb lesz a fluoreszcencia intenzitás, abban az esetben, ha jelen volt a Pgp. A FACS vizsgálat során mértük a sejteken belüli fluoreszcenciás aktivitás mértékét. Ahhoz, hogy összehasonlíthatóvá váljon a gátlás nélküli és a gátlóanyagokat tartalmazó sejtek eltérő fluoreszcenciás aktivitása, ki kellett számolnunk az ún. MAF- (multidrug rezisztencia aktivitási faktor-) értékeket. Ezek jellemzik a sejtek Pgp funkcióját. A lymphoma esetében pedig immunfenotipizálást is végeztünk, ezáltal nemcsak a T-és Bsejtes lymphomát tudtuk elkülöníteni, hanem a lymphoma szubtípusokat is. Ehhez különböző sejtfelszíni CD markereket használtunk, így megfelelő jelölés és inkubálás után a sejtek expresszálták az adott markert.